基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/ 研究·

冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

韋 斌1 ，王 強(qiáng)1 ，姜 浩2 ，朱志華1 ，陳廣琴1 ，尹 瑋1 ，駱 虹1

摘要: 目的  觀察冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的病理變化，進(jìn)一步證實(shí)冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 將 48 只新西蘭大白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥對(duì)照組、冠通方大劑量組、冠通方中劑量組、冠通方小劑量組，每組各 8 只。各組分別連續(xù)灌胃 14 d，制備左室心肌病理切片。比較各組病理切片在光鏡下心肌細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化，使用原位末端標(biāo)記法( TUNEL 法) 測(cè)定各組凋亡細(xì)胞指數(shù)。結(jié)果 冠通方大、中劑量組心肌細(xì)胞在光鏡下的結(jié)構(gòu)形態(tài)得到較好的保護(hù)，冠通方大、中劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組顯著下降( P ＜0．05) 。結(jié)論    冠通方可以減輕心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞的損傷，有效減少心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

關(guān)鍵詞: 心肌缺血再灌注損傷; 冠通方; 機(jī)制研究

中圖分類號(hào): Ｒ542．2    Ｒ285．5    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A    doi: 10．3969 / j．issn．1672-1349．2017．13．008    文章編號(hào): 1672-1349( 2017) 13-1569-04

心肌缺血再灌注損傷( myocardial ischemia reperfu- sion injury，MIＲI) 是心臟缺血性病變?cè)偻ê蟪Ｒ?jiàn)的并發(fā)癥，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理  等方面發(fā)生進(jìn)一步損傷，并可出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌細(xì)胞內(nèi) 凋亡基因的表達(dá)增高或心肌細(xì)胞凋亡。冠通方的近期 藥理研究表明［1］:  使用冠通方預(yù)處理可使缺血再灌注損傷( IＲI) 大鼠模型的損傷心肌組織中白細(xì)胞介素-8 ( IL-8) 表達(dá)下降，白細(xì)胞介素-10( IL-10) 表達(dá)增高，有效抑制炎癥機(jī)制及壞死機(jī)制，起保護(hù)心肌的作用。本 研究通過(guò)后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量的冠通方干預(yù)兔  心臟再灌注損傷后心肌細(xì)胞的凋亡及病理形態(tài)改變， 進(jìn)一步驗(yàn)證了冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 48 只新西蘭大白兔，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK( 桂) 2011-0003］，體質(zhì)量 2．5 kg ～ 3 kg，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后開(kāi)始分組。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥wu 冠通方組成: 田七 45  g，生曬參 100 g，丹參 150 g，地龍 150 g，全瓜蔞 150 g，絞股藍(lán) 150 g，麥冬 150  g，陳皮 100  g。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠按上述配方制成顆粒劑( 每包含生藥 4 g) ，分裝規(guī)格為每包 3．5 g。復(fù)方丹參滴丸( 每粒 27  mg) ，由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)( 國(guó)藥準(zhǔn)字 Z10950111，生產(chǎn)批號(hào) 101210) 。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒為德國(guó) Ｒoche 公司生產(chǎn)，－20 ℃ 保存，使用前置于 4 ℃溶解混合; DAB 顯色液試劑盒為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，4 ℃ 保存，使用前置于室溫與稀釋液以 1∶ 25 稀釋混合，現(xiàn)配現(xiàn)用; 蛋白酶 K 溶液為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，－20 ℃ 保存，使用前置于 4 ℃以 1 ∶ 25 稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用; 磷酸鹽緩沖液( PBS) 為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，粉劑－ 4 ℃ 保存，使用前置于37 ℃ 與蒸餾水0 ． 01 mol / L 稀釋，pH 為7 ． 2 ～ 7．4，現(xiàn)配現(xiàn)用; 其余甲醛、酒精、二甲苯等均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，室溫避光密封保存。全自動(dòng)脫水機(jī)( 德國(guó) Leica，ASP300S) ，石蠟切片機(jī)( 德國(guó) Leica，ＲM2245) ，奧林巴斯顯微鏡( 日本  OLYMPUS， BX53) ，病理圖文攝像頭( 日本OLYMPUS，DP73) ，小動(dòng)物呼吸機(jī)( 北京智鼠多寶生物科技有限公司，DW-3000) 。

       1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 將 48 只新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為 6 組，分別為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥對(duì)照組［復(fù)方丹參滴丸 54 mg / ( kg·d) ］、冠通方大劑量組［3．6 g / ( kg·d) ］、冠通方中劑量組［1．8 g / ( kg·d) ］、冠通方小劑量組［0．9 g / ( kg·d) ］，每組 8 只。用藥劑量根據(jù)人兔臨床用藥劑量換算公式［2］換算成兔用藥量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行分籠飼養(yǎng)，于每天早上灌胃給藥，假手術(shù)組和模型對(duì)照組予蒸餾水灌胃。各組均連續(xù)灌胃14 d，于末次給藥 1 h 后進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.4.2 2 模型建立 經(jīng)耳緣靜脈注射戊ba比妥鈉 30 mg / kg 麻醉后，背位固定，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)  Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離頸前肌， 切開(kāi)氣管，插入 Y 型氣管插管，連接微型人工 呼吸機(jī)( 潮氣量1 0 mL / kg ～ 1 5 mL / kg ，頻 率4 0次/ min) 。沿胸骨左緣 3 ～ 4 肋間隙開(kāi)胸，暴露心臟。采用 5 ～ 0 線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(  LAD)  法制備心肌缺血再灌注模型，為避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌梗死面積過(guò)大導(dǎo)致死亡， 冠狀動(dòng)脈阻斷點(diǎn)應(yīng)在冠狀動(dòng)脈左前降支向下 5 mm ～ 10 mm 處選擇結(jié)扎位點(diǎn)，以心電圖出現(xiàn) ST段弓背抬高和結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗、局部節(jié)段性運(yùn)動(dòng)bu良為結(jié)扎成功。待結(jié)扎 40 min 后剪斷手術(shù)線實(shí)現(xiàn)再灌注，灌注時(shí)間為 2 h。以缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅并反應(yīng)性充血、收縮活動(dòng)逐漸恢復(fù)、ST 段恢復(fù) 1 /2 以上為再灌注成功。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余操作同上。

標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)IＲI 心肌組織 HE 染色病理切片 造模實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，剪下心臟，造模實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，剪下心臟，取左心室心肌( 包括缺血邊緣區(qū)、心肌缺血區(qū)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎區(qū)心肌組織) 。將標(biāo)本置于 10% 中性甲醛液中固定，經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水 14 h，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片厚 4 μm，常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行 HE 染色、封片，鏡下觀察心肌組織基本病理改變。

1.4.2.1 TUNEL 法染色 參考羅氏 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用 0．3%過(guò)氧化氫溶液封閉 30 min; 20 mg / L 蛋白酶 K 消化膜蛋白及核蛋白; 加入TUNEL 反應(yīng)液，37  ℃ 孵育 60  min; 加入 FITC 標(biāo)記抗體，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。

1.4.2.2 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測(cè)量   在光鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，電鏡下呈棕色顆粒者為染色陽(yáng)性的凋亡心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)觀察:  每只兔子觀察4 張切片，每張切片在高倍鏡下( 400 ×) 隨機(jī)觀察 5 個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)算凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)和所有細(xì)胞個(gè)數(shù)，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/ 總細(xì)胞數(shù)的百分比為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    本研究采用 SPSS Statistics 19．0 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用單因素方差分析，計(jì)量資料以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s ) 表示，組間比較用q 檢驗(yàn)，以P ＜

0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。