益智乙醇提取物**抗氧化及改善小鼠認(rèn)知狀況活性研究

趙嘉寶¹，蘇 航¹，齊 鈺¹，肖 鋒²，畢開(kāi)順³，賈 英²*

( 1． 沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽(yáng)市中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016; 2． 沈陽(yáng)藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院，沈陽(yáng)市中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016; 3． 沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，中藥質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

摘要: 目的 考察益智醇提取物體外**抗氧化活性以及改善小鼠認(rèn)知狀況的能力。方法 以益智醇提取物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象， 采用小鼠足腫脹、腹腔注射醋酸致****通透性改變等實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)小鼠致炎部位前列腺素 E2 含量和肝勻漿中丙二 醛含量，來(lái)評(píng)估益智醇提取物的**抗氧化活性。采用 Morris 水迷宮法，檢測(cè)益智提取物對(duì)于阿爾茲海默病( AD) 模型 小鼠認(rèn)知狀況改善能力。結(jié)果 益智醇提取物在小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)及醋酸致小鼠腹腔****通透性改變實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出和阿司匹林接近的**活性，其對(duì)小鼠后足腫脹抑制率達(dá)到 61． 60% ，炎癥組織中致炎因子含量對(duì)比于對(duì)照組表現(xiàn)出顯著抑制情況( P ＜ 0． 01) 。益智醇提取物在小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，抑制率達(dá)到 32． 50% ， 效果接近維生素 C。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示益智提取物能夠改善 AD 模型小鼠認(rèn)知狀況，且效果和多奈哌齊效果接近。結(jié) 論 益智提取物表現(xiàn)出良好的**抗氧化以及改善小鼠認(rèn)知狀況活性。

關(guān)鍵詞: 益智; 提取物; **; 抗氧化; 認(rèn)知狀況

DOI 標(biāo)識(shí): doi: 10． 3969 /j． issn． 1008-0805． 2017． 05． 013

中圖分類號(hào): Ｒ285． 5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1008-0805( 2017) 05-1057-03

炎癥反應(yīng)是機(jī)體內(nèi)部基本病理反應(yīng)過(guò)程，其發(fā)**展伴隨著 一系列炎癥因子的復(fù)雜變化，過(guò)度激活會(huì)影響機(jī)體正常代謝過(guò) 程。氧化應(yīng)激是指機(jī)體氧化還原水平失衡，產(chǎn)生過(guò)多的氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降，*終導(dǎo)致組織損傷［1］，引起一系列**的發(fā)生，例如: 阿爾茲海默病［2，3］、糖尿病［4］ 等。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是很多**的發(fā)病原因或促進(jìn)因素，**如果具有抗 炎或抗氧化活性，則能夠在一定程度上****，例如**** 及具有**活性或抗氧化活性的提取物對(duì)于阿爾茲海默病的治療［5 ～ 7］。益智為姜科植物益智 Alpinia  oxyphylla  Miq． 的干燥成熟果實(shí)，有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功效［8］，是衛(wèi)生部認(rèn)定的藥食同源的物品之一。本文對(duì)益智提取物的**抗氧化以及 改善 AD 模型小鼠認(rèn)知狀況活性做了深入研究。以小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)和腹腔注射醋酸致血管滲透性增高實(shí)驗(yàn)以及致炎部位前列 腺素  E2  的含量測(cè)定來(lái)評(píng)估**的**效果，以肝組織自氧化程度測(cè)定來(lái)評(píng)估**的體外抗氧化效果，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益智 提取物表現(xiàn)出良好的**抗氧化活性。同時(shí)，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明益智提取物能夠改善 AD 模型小鼠認(rèn)知狀況，但是其產(chǎn)生此效果的原因尚不明確，需要進(jìn)行更深入研究探索。

1 材料與儀器

1． 1    動(dòng)物  昆明小鼠，雄性，體重 25g，購(gòu)自沈陽(yáng)藥科大學(xué)動(dòng)物管理中心，適應(yīng)環(huán)境 3 天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。合格證號(hào): SSYPU － IACUC － C2016 － 0506 － 103。

1． 2    材料和儀器  材料: 益智仁購(gòu)自沈陽(yáng)市同仁堂藥房，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室賈英教授鑒定，均為**，密封存放于陰涼干燥處。伊文思藍(lán)( 購(gòu)自 Sigma 公司，批號(hào) 314 － 13 － 6) ，硫代***酸( 購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào) 504 － 17 － 6) ， 二甲基亞砜、生理鹽水、三***、氫氧化鉀、甲醇、95% 乙醇、冰醋酸( 購(gòu)自山東禹王化學(xué)試劑有限公司) ，阿司匹林腸溶片( 購(gòu)自國(guó)大藥房) ，多奈哌齊( 購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司) 。

1. 3 儀器 HH － 4 型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋( 國(guó)華電器有限公司) ; ＲE － 52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海亞榮生化儀器廠) ; Varioskan Flash 酶標(biāo)儀( 賽默飛世爾科技公司) ; Morris 水迷宮( 北京智鼠多寶有限公司) 。

2 方法

2. 1 益智提取物的制備 益智粉碎，過(guò) 60 目篩，稱取益智粉末500  g，加入兩倍體積 95% 乙醇，加熱回流 3 次，每次 3  h，合并濾液蒸干后得益智醇提取物 89． 2  g。

2． 2     小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)  小鼠隨機(jī)分為 4 組，每組 6 只，分別為: ( 1) 對(duì)照組，灌胃給予 CMC － Na; ( 2) 陽(yáng)**組，灌胃給予阿司匹林腸溶片溶液; ( 3 ) 益智提取物低劑量給藥組，劑量 30 mg · kg － 1 ，灌胃給藥; ( 4) 益智提取物高劑量給藥組，劑量 60 mg ·

kg － 1 ，灌胃給藥。小鼠連續(xù)給藥 5d，給藥劑量 0． 1  ml·10  g － 1 。末次給藥后 1 h，在小鼠后兩足足踝處同一位置各作一標(biāo)記，在右后足足墊部注射新鮮配置的雞蛋清溶液 0． 05  ml，于注射 1  h 后剪下后兩足，稱重，計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率。

2． 3    炎癥組織中前列腺素 E2 ( PGE2 ) 含量測(cè)定  將剪下的致炎足浸于 5  ml 生理鹽水中，剪碎，浸泡 2  h 后，3000  r·min － 1 離心 10  min。取上清液 0． 2  ml，加入 0． 5  mol·L － 1   KOH·甲醇溶液 2 ml，在 50℃ 水浴異構(gòu)化 20  min 后，用甲醇定容到 4  ml，在 278  nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值，以此值代表 PGE2 的含量。

2． 4    醋酸所致小鼠****通透性增高實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為 4組，每組 6 只，分組和給**式同“2． 2”。末次給藥 1  h 后，小鼠尾靜脈注射 0． 5% 伊文思藍(lán)生理鹽水溶液 0． 1  ml·10  g － 1 ，隨后腹腔注射 0． 6% 醋酸溶液 0． 1  ml·10  g － 1 ，20  min 后處死小鼠，腹腔注射 6 ml 生理鹽水，輕揉小鼠腹部，剪開(kāi)小鼠腹部皮毛，暴露腹腔，收集腹腔液，3000  r·min － 1 ，離心 10  min，590  nm 測(cè)吸光度值，比較各組吸光度值，觀察小鼠****通透性的改變狀況。

2． 5    小鼠肝組織勻漿內(nèi)丙二醛( MDA) 含量測(cè)定  取小鼠處死后迅速分離肝組織，用冷生理鹽水洗凈，冰浴勻漿，制成肝勻漿。取4 支試管，每支加入肝勻漿 0． 5  ml，分別加入 3% 過(guò)氧化氫溶液0． 2  ml，再分別加入 1  ml 樣品( DMSO，Vc 溶液 1  mg·ml － 1 ，益智mg·ml － 1 ，益智 6 mg·ml － 1 ，樣品皆溶于 DMSO 中配置) ，37 ℃溫浴 1  h，加入 20%  三***溶液 1  ml，0． 67% 硫代***酸溶液 1  ml，沸水浴 15  min，冷卻后，4000  r· min － 1 離心 10  min，532nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，此值作為肝勻漿中 MDA 的含量，并計(jì)算抑制率，每個(gè)樣品做 2 個(gè)平行樣。

2． 6    益智醇提取物對(duì)于改善小鼠認(rèn)知狀況活性測(cè)試  小鼠隨機(jī)分為 6 組，每組 6 只，分別為: ( 1) 空白組，灌胃給予 CMC － Na; ( 2) 對(duì)照組，小鼠腦室注射 Aβ 3 μl 后恢復(fù)三天，灌胃給予 CMC － Na; ( 3) 陽(yáng)**組，小鼠腦室注射 Aβ 3 μl 后恢復(fù) 3 天，灌胃給予多奈哌齊溶液 3 mg·kg － 1 ; ( 4) 益智提取物低劑量給藥組，小鼠腦室注射 Aβ 3 μl 后恢復(fù) 3 天，灌胃給藥劑量 30 mg·kg － 1 ; ( 5)

益智提取物高劑量給藥組，小鼠腦室注射 Aβ 3 μl 后恢復(fù) 3 天， 灌胃給藥劑量 60  mg·kg － 1 ; ( 6) 空白給藥組，灌胃給予益智提取物 60  mg·kg － 1 。腦室注射定位: AP，－ 0． 5mm; ML，－ 1． 1mm; DV，－ 3． 0mm。小鼠連續(xù)給藥 30 天，給藥劑量 0． 1  ml·10  g － 1 。給藥結(jié)束后，小鼠進(jìn)行為期 6  天的 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，操作方法參考文獻(xiàn)［9］。

2. 7    統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用 SPSS 16． 0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“x珋± s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，以 P ＜ 0． 05 為顯著差異節(jié)點(diǎn)。

3 結(jié)果

1      小鼠足腫脹結(jié)果  各組小鼠左足在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后重量無(wú)顯著差異，可以排除小鼠個(gè)體差異性對(duì)鼠足重量的影響。小鼠右足經(jīng)   過(guò)雞蛋清注射處理 1 h 后，對(duì)比于對(duì)照組，給藥組表現(xiàn)出顯著的腫脹情況，其中阿司匹林組( P ＜ 0． 05，抑制率 80． 70% ) 、低劑量給藥組( P ＜ 0． 05，抑制率 79． 40% ) 表現(xiàn)出顯著的腫脹抑制。此結(jié)果表明，益智醇提取物能夠抑制雞蛋清導(dǎo)致的小鼠腫脹情況， 且低劑量表現(xiàn)出更好的效果，腫脹抑制率數(shù)據(jù)也支持這一結(jié)論。 小鼠致炎后致炎部位腫脹度及腫脹抑制率結(jié)果見(jiàn)表 1。

3． 2    小鼠致炎部位 PGE2   含量測(cè)定結(jié)果  由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)比與對(duì)照組，阿司匹林組、低劑量組、高劑量組都表現(xiàn)出顯著的致炎部位 PGE2   含量降低的現(xiàn)象( P ＜ 0． 01) ，PGE2   作為體內(nèi)一種典型的炎癥指標(biāo)，它的含量降低表明給藥降低了組織炎癥。三個(gè)給藥 組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，低劑量組和阿司匹林組效果更接近，表現(xiàn)出更好的 **活性。小鼠致炎部位 PGE2 含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖 1。

3． 3    醋酸所致小鼠****通透性增高實(shí)驗(yàn)結(jié)果  此實(shí)驗(yàn)結(jié)果和“3． 2”實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，三個(gè)給藥組表現(xiàn)出顯著的降低小鼠****通透性的狀況( P ＜ 0． 01) ，其中低劑量組效果和陽(yáng)**組效果*接近，**效果更優(yōu)。醋酸所致小鼠****通透性增高實(shí)  驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 2。

3． 4    小鼠肝組織勻漿內(nèi) MDA 含量測(cè)定結(jié)果  MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量代表體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度。由實(shí)驗(yàn)  結(jié)果可知，對(duì)比于對(duì)照組，三個(gè)給藥組都表現(xiàn)出顯著的肝勻漿內(nèi)MDA 含量降低的現(xiàn)象，其中低劑量組的降低效果與 Vc 組更接近，抗氧化活性更顯著。小鼠肝組織勻漿內(nèi) MDA 含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 2。

3． 5    益智提取物對(duì)于改善小鼠認(rèn)知狀況活性研究  水迷宮的逃避潛伏期能夠反映動(dòng)物短期記憶能力，時(shí)間越短代表動(dòng)物記憶認(rèn)知能力越好。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，**天和**天各組小鼠逃避潛伏期未表現(xiàn)出顯著差異，第三天開(kāi)始，相比于模型組，空白組和給藥組陸續(xù)表現(xiàn)出逃避潛伏期時(shí)間顯著縮短，表明**能夠改善小鼠認(rèn)知狀況和記憶能力，且益智高劑量組效果優(yōu)于低劑量組，和多奈哌齊給藥組更為接近。另外，空白給藥組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 益智提取物對(duì)于正常小鼠無(wú)抑制作用，一定程度上表明益智提取物對(duì)于動(dòng)物不產(chǎn)生毒性作用。益智提取物對(duì)于改善小鼠認(rèn)知狀況活性研究結(jié)果見(jiàn)表 3。

4 討論

益智作為中藥材，其化學(xué)成分和藥理作用已得到多方考察和 研究。除藥典記錄的功效外，益智已被證實(shí)還具有**［10］、抗過(guò)  敏［11］、抗氧化［12］、改善學(xué)習(xí)記憶能力［13］、保護(hù)胃腸道系統(tǒng)［14］、神  經(jīng)保護(hù)［15］、鎮(zhèn)痛［16］等功效，而益智醇提取物中所含化學(xué)成分，例  如: 益智酮甲、益智醇、諾卡酮［17］、白楊素、楊芽黃素［18］、山萘酚

－ 4＇－ 0 － 甲醚［19］等，和這些藥理活性緊密聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)選用益智作為原材料，經(jīng)過(guò)提取得到其醇提取物，并 對(duì)其**抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示其對(duì)于小鼠足腫脹和 醋酸所致****通透性升高有顯著的抑制作用，對(duì)肝勻漿內(nèi)MDA 含量測(cè)定結(jié)果也表現(xiàn)出其具有顯著的抗氧化活性。在我們的實(shí)驗(yàn)中，益智低劑量 30 mg·kg － 1 比高劑量 60 mg·kg － 1 表現(xiàn)出更好的**抗氧化活性。基于**的抗氧化能力和其對(duì)抗 AD 的能力息息相關(guān)，我們隨后進(jìn)行了 AD 模型小鼠的認(rèn)知狀況和記憶能力考察實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益智提取物表現(xiàn)出良好的改善認(rèn) 知狀況的能力，但是高劑量組 60 mg·kg － 1 比低劑量 30 mg·kg － 1 效果更好，這與體外抗氧化**實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，表明體外實(shí)驗(yàn) 結(jié)果不能完全套用到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，兩者應(yīng)結(jié)合考察。因此在今后 的研究中，我們會(huì)繼續(xù)使用益智提取物進(jìn)行給藥，以其進(jìn)入體內(nèi) 轉(zhuǎn)化形式和代謝途徑為主要研究方向進(jìn)行深入探索，研究其改善 認(rèn)知狀況的根本原因。