侯永春 嚴 孜1 ( 江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004)

〔摘    要〕 目的    觀察參苓散對脾陰虛癡呆( AD) 大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( BDNF) 、神經(jīng)生長因子( NGF) 表達的影響。方法     將 48 只體重( 300 ± 20) g 的健康雄性大鼠，隨機分成空白組( 空白對照) 、陰虛組( 脾陰虛) 、AD 組( 脾陰虛 + AD) 和 組( 脾陰虛 + AD ) ，每組 12 只。通過病證結(jié)合的方法建立脾陰虛 AD 大鼠模型，組給予中藥參苓散灌胃，每日1 ml /100 g，持續(xù)10 d，其他各組每日予等體積生理鹽水灌胃。采用Morris 水迷宮測試各組大鼠學習記憶能力，用疫組化( SP) 方法觀察大鼠海馬區(qū)BDNF 和NGF 的表達。結(jié)果     ①  造模后，陰虛組、AD 組、 組與空白組對比逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)減少( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ; 給予參苓散后，組與陰虛組、AD 組相比，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數(shù)增多( P ＜ 0. 01) ; ②與空白組比較，陰虛組、AD 組大鼠海馬 BDNF、NGF 表達明顯下調(diào)( P ＜ 0. 01) ; 而組大鼠海馬 BDNF、NGF 表達與陰虛組、AD 組比較明顯上調(diào)( P ＜ 0. 01) 。結(jié)論 參苓散能改善脾陰虛 AD 模型大鼠的學習記憶能力，增加其海馬區(qū) BDNF、NGF 表達。

〔關(guān)鍵詞〕 參苓散; 癡呆; 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子; 神經(jīng)生長因子

〔中圖分類號〕 Ｒ749 〔文獻標識碼〕 A 〔文章編號〕 1005-9202( 2014) 03-0728-03; doi: 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 03. 075

老年性癡呆( AD) 是一種樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性**，其進行性的認知功能障礙學習和記憶能力減退〔1〕。中醫(yī)發(fā)現(xiàn)這一病癥與脾虛濕勝、腦竅失養(yǎng)癥狀相似; 同時臨床上也多用補脾益腎增智的方劑。參苓散具有益心力，除謬忘，能飲食，延年益壽的功效。近幾年來發(fā)現(xiàn)大腦海馬區(qū)神經(jīng)因子數(shù)量減少和功能障礙在脾陰虛 AD 發(fā)生與發(fā)展中起到越來越重要的作用〔2〕。本研究觀察參苓散對脾陰虛 AD 大鼠的學習記憶功能的改善作用，用疫組化( SP) 方法觀察大鼠海馬神經(jīng)因子表達的變化，為防治脾陰虛 AD 病提供科學證據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材 料

1. 1. 1 動物 選用清潔級健康雄性 SD 大鼠 48 只，江西中醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號 2011-50，體重( 300 ± 20) g，環(huán)境溫度( 25 ± 2) ℃ ，自然晝夜節(jié)律，顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1. 1. 2    藥品與試劑    參苓散( 藥包括茯苓、人參、甘草等份自配，常規(guī)水煎，藥液含生藥 3. 2 g / ml) 和傷陰藥( 吳茱萸、附子等，常規(guī)水煎，藥液含生藥 1 g / ml) 江西南華制藥有限公司;   鈉注射液，江西科倫藥業(yè)有限公司;   3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷( APES) ; 抗兔 SP 試劑盒，中性磷酸鹽緩沖溶液( PBS) ; 二氨基聯(lián)苯胺( DAB) 顯色劑( 均為中杉金橋) 。

1. 1. 3 儀器    2135 型石蠟切片機( Leica，德國) ，展片、烤片機( 山東紅旗儀器廠，中國) ，DT10K 型電子天平( 江蘇常熟長青儀器儀表廠，中國) ，恒溫箱兼培養(yǎng)箱( 上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠， 中國) ，BX-41 型顯微照相儀( OLYMOUS，日本) ，DB001 型 Mor- ris 水迷宮( 北京智鼠多寶生物科技有限責任公司，中國) 。

1. 2 方法

1. 2. 1    動物分組    48 只健康雄性大鼠稱重后，隨機分成四組: 空白組( 空白對照) 、陰虛組( 脾陰虛) 、AD 組( 脾陰虛 + AD) 和組( 脾陰虛 + AD +) ，每組 12 只。

1 江西中西藥大學科技學院

**作者: 侯永春( 1979-) ，男，講師，主要從事中藥藥理學研究。

1. 2. 2 動物模型復制及給藥

1. 2. 2. 1 脾陰虛證模型 首先對陰虛組、AD 組和組大鼠參照經(jīng)典的復合因素造模法〔3〕進行脾陰虛模型的建立，分為脾氣虛和脾陰虛兩個階段。實驗第 1 ～ 15 天為脾氣虛階段，大鼠單日自由游泳達到耐力極限，禁食飼料，喂甘蘭( 30 g / 只) ; 雙日予豬油脂灌服; 空白組正常喂養(yǎng)，予等量生理鹽水灌服。第 16 ～ 24 天為脾陰虛階段，在脾氣虛的基礎(chǔ)上每日增加傷陰藥 1 ml /100 g ，連續(xù)灌服。而空白組大鼠僅予等體積生理鹽水灌服。

1. 2. 2. 2 脾陰虛 + AD 模型 AD 組、組大鼠繼續(xù)進行AD 模型〔4〕的建立，用 MILLIQ 水將 Aβ1 ～ 40稀釋成 5 μg / μl，37℃ 孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)備用。大鼠經(jīng)腹腔注射2%    鈉( 45 mg / kg) 麻醉后，固定到腦立體定位儀，常規(guī)備皮**，切開皮膚; 選擇雙側(cè)海馬為注射靶區(qū)，取前囟后 3. 5 mm ， 中線旁 2. 0 m ，門齒鉤平面低于耳間線平面 3. 3 mm 處鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自腦表面緩慢垂直進針至硬腦膜下2. 5 mm，AD 各組每側(cè)予以2 μl 淀粉樣蛋白酶( Aβ1 ～ 40 ) 溶液緩慢注入，留針以保證溶液充分彌散，緩慢撤針，縫合切口，皮下注射抗生 防止感染; 空白組和陰虛組大鼠進行同樣手術(shù)， 僅注入等體積 MILLIQ 水，術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)。

1. 2. 3 藥干預 術(shù)后第 4 天對組大鼠給予中藥參苓散灌胃，每日 1  ml /100  g，持續(xù) 10  d，而其余各組大鼠每日予等體積生理鹽水灌胃。

1. 2. 4  Morris 水迷宮試驗   采用 Morris 水迷宮測試各組大鼠造模前、造模后、后學習記憶能力; 具體方法參照 Morris 等〔5〕的方法，分別于 AD 造模術(shù)前、造模術(shù)后第 3 天及結(jié)束后評價各組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺的次數(shù)。

1. 2. 5  標本制備  各組大鼠在進行行為學測試結(jié)束后，立即以致死量 100 g / L 水合氯醛( 350 mg / kg) 腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時剪開右心耳，快速滴入 37℃ 生理鹽水 300  ml，無血污后改為滴入固定液 4℃ 的多聚甲醛 400 ml。待大鼠尾巴完全僵直時迅速斷頭，取出海馬組織，固定于 4% 多聚甲醛溶液中 12 ～24  h，進行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片，厚度約3  μm，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，晾干后置于 60℃的烤箱中烘烤備用。

1. 2. 6 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(  BDNF) 、神經(jīng)生長因子(  NGF)  疫組化檢測     采用 疫組化 SP 法檢測 BDNF 及 NGF 的表達，嚴格按照試劑說明書操作要求進行檢測。在海馬區(qū)隨機選擇 8 個視野，用顯微圖像分析系統(tǒng)下的目鏡，400 倍顯微計數(shù)，計算陽性細胞數(shù)平均數(shù)。

1. 3  統(tǒng)計學方法   應(yīng)用 SPSSV11. 5 軟件進行分析，計量資料以 x ± s 表示，組間兩兩比較采用多組定量資料的單因素方差分析 LSD 法。

2 結(jié) 果

2. 1 定位航行試驗      造模前各組大鼠定位航行試驗逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異( P ＞ 0. 05) ，具有可比性; 造模后，陰虛組、AD 組、組與空白組對比逃避潛伏期明顯延長( P ＜ 0. 05 或P ＜ 0. 01) 。給予中藥參苓散灌胃后，與陰虛組、AD 組相比，組逃避潛伏期明顯縮短( P ＜ 0. 05) 。見表 1。

 2. 2    空間探索試驗     造模前各組大鼠空間探索試驗穿越平臺次數(shù)無統(tǒng)計學差異( P ＞ 0. 05) ，且有可比性。造模后，陰虛組、AD 組、組與空白組對比穿越平臺次數(shù)明顯減少( P ＜0. 01) ; 其中組、AD 組與陰虛組比較，穿越平臺次數(shù)明顯減少( P ＜ 0. 01) 。給予中藥參苓散灌胃后，與陰虛組、AD 組相比，組穿越平臺次數(shù)明顯增加( P ＜ 0. 01) 。見表 2。

2. 3  各組大鼠 BDNF、NGF 表達情況   與空白組比較，陰虛組、AD 組大鼠海馬 BDNF、NGF 表達明顯下調(diào)( P ＜ 0. 01) ; 而組與陰虛組、AD 組比較明顯上調(diào)( P ＜ 0. 01) 。見表 3、圖 1。

    3 討 論

AD 呈逐年上升的趨勢，至今還沒有令人滿意的方法， 中** AD 給人們提出了新思路。本研究結(jié)果表明參苓散灌服能夠明顯提高脾陰虛 AD 大鼠的學習和記憶能力，改善認知功能。

海馬結(jié)構(gòu)作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在學習和記 憶等上等神經(jīng)活動中起關(guān)鍵作用，海馬神經(jīng)元損害可能是 AD 的重要病理基礎(chǔ)之一。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類對神經(jīng)有特異性的蛋白質(zhì)，BDNF 和 NGF 就是其中的代表。隨著對其深入研究，人們發(fā)現(xiàn)它們具有明確的促進和維持神經(jīng)細胞分化、生長 和存活作用，在改善認知功能方面也有重要作用〔6 ～ 8〕。但中藥方參苓散能否促進慢性腦缺血大鼠 BNF 的表達，目前國內(nèi)外未見報道。本研究結(jié)果提示參苓散能通過啟動 BDNF 的表達加強腦缺血后的內(nèi)源性修復過程，這可能是內(nèi)服參苓散后機體 對腦進行保護作用的一種機制。

AD   屬中醫(yī)學的“癡證”、“呆病”等范疇，中醫(yī)學認為引起本病的基本原因是肝腎虧虛、氣血不足、經(jīng)脈失養(yǎng)、髓海不足。 而脾胃為后天化生之源，脾胃氣健則先天腎氣充實，髓海得養(yǎng)。 參苓散方中人參大補元氣，以生中氣，健脾益肺，以助運化，益   智 神，以充髓海;   更有茯苓協(xié)助利水滲濕，調(diào)補脾陰，益心脾而寧心 神，炙甘草**補中，調(diào)和諸藥，共奏健脾 神之功。

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        〔2012-11-26 收稿 2013-02-12 修回〕

       ( 編輯 袁左鳴)