肺缺血再灌注損傷模型犬接受去氫駱駝蓬堿干預后無明顯肺保護作用
張皓，齊海，李元明，陳家驊(新疆醫(yī)科大學**附屬醫(yī)院胸心外科，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市830063)
文章亮點：
1 實驗采用犬肺常溫缺血再灌注模型，進行熱灌注肺保護液，在國內(nèi)同類研究中較為少見。
2 有研究表明，去氫駱駝蓬堿有一定的抑制炎癥反應、抗氧化的作用。文章率先通過分析細胞因子水平、肺
濕/干質(zhì)量比、肺動脈壓力等實驗指標探討去氫駱駝蓬堿對肺的保護作用，具有一定的**性。
3 實驗選擇短時間常溫缺血再灌注放大了同等時間冷缺血再灌注損傷，具有節(jié)省實驗時間、實驗動物易于耐
受、模型建立操作方便的效果。
關鍵詞：
實驗動物；組織構(gòu)建；去氫駱駝蓬堿；低鉀右旋糖酐液；缺血再灌注；損傷；肺；常溫；動物模型
主題詞：
模型，動物；再灌注損傷；肺；右旋糖酐類；哈爾明
摘要
背景：
炎性細胞活化、氧自由基的產(chǎn)生是肺缺血再灌注損傷發(fā)生的重要因素。在常用的肺保護液中增加可能具有抑制炎癥、抗氧化作用的**，使保護液進行一定的改良，對肺缺血再灌注損傷的研究及保護移植肺的功能具有重要的意義。
目的：
探討去氫駱駝蓬堿對犬肺缺血再灌注損傷的作用。
方法：將 12 只健康雜交犬隨機分為兩組，每組 6 只。建立犬肺缺血再灌注損傷模型，采用順灌方式行保護液肺灌注，實驗組給予低鉀右旋糖苷保護液+去氫駱駝蓬堿溶液灌注，對照組給予低鉀右旋糖苷保護液。缺血2 h 后，恢復左肺循環(huán)，兩組于再灌注后采集左肺組織及血液標本，檢測細胞因子水平，計算肺濕/干質(zhì)量比； 收集支氣管肺泡灌洗液，觀察各項病理指標；連續(xù)測量記錄主肺動脈壓、左肺動脈壓和右肺動脈壓。
結(jié)果與結(jié)論：
兩組于再灌注 2，4 h 時左肺組織及血液中的白細胞介素 17、腫瘤壞死因子 α 及內(nèi)皮素 1 水平差異均無顯著性意義(P> 0.05)，兩組再灌注 4 h 后的支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞數(shù)目、**細胞數(shù)目、肺泡損傷指數(shù)及血管壁水腫程度差異均無顯著性意義(P> 0.05)，兩組肺濕/干質(zhì)量比差異均無顯著性意義(P> 0.05)，經(jīng)方差分析，兩組主肺動脈壓、左肺動脈壓及右肺動脈壓差異均無顯著性意義(P> 0.05)。結(jié)果可見通過對細胞因子、病理指標、肺組織濕/干質(zhì)量比及肺動脈壓力分析，去氫駱駝蓬堿在犬肺原位常溫缺血再灌注損傷模型中沒有明顯的肺保護作用。
張皓，齊海，李元明，陳家驊. 肺缺血再灌注損傷模型犬接受去氫駱駝蓬堿干預后無明顯肺保護作用[J].中國
組織工程研究，2014，18(36):5805-5812.
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引言
Introduction
隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，器官移植在臨床上成為了現(xiàn)實和可能。肺移植對于終末期肺部**是一種有效的**方法[1]，然而，肺缺血再灌注損傷的出現(xiàn)，成為早期移植肺失敗的主要原因，導致移植后發(fā)生原發(fā)性移植肺功能障礙[2]。肺缺血再灌注損傷是某種原因使肺組織遭受一定時間的缺血，恢復血液灌流(再灌注)后，缺血、缺氧引起的肺損傷沒有減輕，反而加重的病理現(xiàn)象[3]。它常見于肺移植、肺葉切除、體外循環(huán)等，尤其在肺移植手術中發(fā)生率*高[4-6]。因此，減輕肺缺血再灌注損傷以及闡明其發(fā)病機制已經(jīng)成為亟待解決的難題。多年來，針對如何減輕肺缺血再灌注損傷進行了大量的實驗和臨床研究，但極少具有應用價值[7]。研究證實，目前*為有效、穩(wěn)定的辦法是行保護液肺灌注。常用的肺保護液分兩類，一類是細胞內(nèi)液型(高鉀低鈉)保護液，以EC(Euro-Collins)液為代表；另一類為細胞外液型(低鉀高鈉)保護液，以低鉀右旋糖酐(LPD)液為主。1991年，第2 屆國際終末期肺**移植會議明確EC液作為臨床肺保護液[8]。但學者們對兩類不同保護液的肺保護作用看法不一，大多數(shù)認為：細胞內(nèi)液型保護液含有高濃度K+ ，可抑制血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞膜內(nèi)K+ 外流，導致細胞膜靜息電位的**值減小，易使細胞膜外Na+內(nèi)流，引起細胞膜去極化、發(fā)生動作電位，觸發(fā)Ca通道開放、Ca2+向膜內(nèi)流動，造成平滑肌細胞收縮、內(nèi)皮細胞釋放內(nèi)皮素，從而導致血管收縮，增加肺循環(huán)阻力和促進肺部水腫，進而加重肺損害。而含有低濃度K+的低鉀右旋糖酐液無此現(xiàn)象[9]。對于K+ 濃度的適宜性問題，Bando等[10]和Muller等[11]進行了深入研究，證實了細胞外液型保護液優(yōu)于細胞內(nèi)液型保護液，提出了灌注液K+的濃度不應太高也不應太低，*適宜在20-40 mmol/L。除此之外，低鉀右旋糖酐液在保護肺泡上皮功能和內(nèi)皮細胞新陳代謝方面與EC液比較也有一定的優(yōu)勢[12]。Gamez等[13]通過臨床研究報道，在肺移植后早期恢復階段，低鉀右旋糖酐液可以明顯降低約50%的肺缺血再灌注損傷發(fā)生率。因此對于肺保護來說，特別是在早期移植物功能的保護方面，細胞外液型保護液較細胞內(nèi)液型更有應用價值[14]?，F(xiàn)今，臨床**和實驗研究中多使用低鉀右旋糖酐液作為肺保護液的優(yōu)選，除低濃度鉀對血管有保護作用外，還認為含有的葡萄糖可以為細胞供能以及增加能量儲備，提高移植肺的功能。Chu等[15]提出，在保護液中添加其他保護成分比單純使用肺保護液更有價值。如有學者報道在低鉀右旋糖酐液中增加參附注射液、谷胱甘肽、西地那非等，都取得了較好的肺保護效果。因此在肺保護液中添加**成分，對其進行改良，成為減輕肺缺血再灌注損傷研究的重點和方向。
去氫駱駝蓬堿又稱為哈爾明堿(harmine，HM)，為β-咔啉類生物堿，是植物駱駝蓬種子中的主要成分[16-17]。近幾年，不少學者對去氫駱駝蓬堿的藥理作用進行了研究，得出不同的結(jié)論。Khan等
[16]發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿對用腎上腺素和氯化鉀溶液處理后收縮的大鼠離體胸部大動脈有血管舒張作用，其機制與促進血管內(nèi)皮細胞釋放血管舒張因子及微弱的與Ca2+通道結(jié)合，非競爭性抑制Ca
2+內(nèi)流作用有關。Berrougui等[18]研究認為駱駝蓬堿能夠舒張血管，去氫駱駝蓬堿則無此作用。Moura等[19]研究提出去氫駱駝蓬堿可以作為活性氧的**劑。Chen等[20]及Yamazaki等
[21]研究發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿可以抑制腫瘤壞死因子α、誘導型一氧化氮合酶的產(chǎn)生，來發(fā)揮**作用。
Bi等[22]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿能夠減輕腸系膜缺血再灌注損傷，提出活性氧增多和炎性細胞活化在缺血再灌注損傷中扮演重要角色，認為β-咔啉類生物堿具有潛在的抗氧化能力。
目前國內(nèi)外文獻報道中，尚未見有關去氫駱駝蓬堿對肺缺血再灌注損傷作用的研究。本實驗對低鉀右旋糖酐液進行改良(加入去氫駱駝蓬堿液)，以犬模擬臨床肺移植過程中出現(xiàn)的肺缺血再灌注損傷，通過觀測白細胞介素17、腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素1、肺泡損傷指數(shù)、支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞及**細胞數(shù)目、肺濕/干質(zhì)量比、肺動脈壓等實驗指標，探討去氫駱駝蓬堿對犬肺缺血再灌注損傷的影響及可能機制。
1材料和方法 Materials and methods
設計：隨機對照動物實驗。
時間及地點：實驗于2009年9月至2012年11月在新疆醫(yī)科大學**附屬醫(yī)院外科實驗中心完成。
材料：
實驗動物：
健康成年雜交犬12只，雌雄不限，體質(zhì)量 20-31 kg，平均(27.333±3.339) kg，犬齡12-16個月，平均(13.668±1.435)個月，由新疆醫(yī)科大學**附屬醫(yī)院外科實驗中心提供。實驗前1周進行動物觀察，手術前給予禁食12 h，禁水4 h。12只犬的體質(zhì)量、性別、年齡經(jīng)統(tǒng)計學分析差異無顯著性意義。該實驗方案經(jīng)過新疆醫(yī)科大學**附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查并批準，所有實驗動物得到了人道關懷。
實驗方法：
實驗分組：對實驗犬依次編號(1-12號)，按照隨機排列表方法將12只犬分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組為低鉀右旋糖苷+去氫駱駝蓬堿保護液灌洗組；對照組為低鉀右旋糖苷保護液灌洗組。
建立犬肺原位常溫缺血再灌注損傷動物模型：
①術前 準備：室溫27℃，呼吸機、心電監(jiān)護儀安放于手術臺一側(cè)， 手術器械擺放在手術托盤上，犬禁食12 h，禁水4 h。②麻 醉處理：實驗犬肌注阿托品，靜脈給予芬太N(10 μg/kg)、 丙泊酚(2 mg/kg)進行**麻醉。麻醉起效后，取仰臥位、備皮，四肢固定于手術臺上。插導尿管接尿袋，**管插管接呼吸機，機械通氣：潮氣量15-20 mL/kg，頻率20次/min， 氧濃度為60%。行持續(xù)心電監(jiān)測，于左或右側(cè)頸外靜脈處插管，給予生理鹽水溶液滴注維持。③手術操作：備皮區(qū)碘伏**3遍，鋪無菌巾。選擇雙側(cè)第4或第5肋間，作橫行切口，離斷胸骨進入胸腔?？v行切開心包并懸吊(左側(cè)部 分懸吊)，解剖肺動脈主干及左右各支、左右肺靜脈上中下各支及左主支氣管并充分游離、暴露。主肺動脈近心端插入測壓管，荷包縫合固定，持續(xù)記錄犬主肺動脈壓、左右肺動脈壓(測定時阻斷對側(cè))，采用間歇測定法，每30 min/次。 左肺動脈遠心端置入灌注管，荷包縫合固定。測壓管、灌注管內(nèi)推注低分子肝素鈉(1 mL/kg)。阻斷前左肺充氣膨脹，右肺動脈繞帶備阻斷。用阻斷鉗夾閉左肺動脈近心端，直角鉗阻斷左主支氣管，縫線結(jié)扎左肺**管及左側(cè)支氣管動靜脈。左肺上中下葉靜脈近心端阻斷，遠心端造口。從左肺動脈灌注管內(nèi)灌注37 ℃保護液，壓力維持在18 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，灌洗量以60 mL/kg計算，采用順灌方式進行。實驗組予低鉀右旋糖苷保護液+去氫駱駝蓬堿溶液灌注，對照組予低鉀右旋糖苷保護液。左肺常溫阻斷2 h后，予相應灌洗液左肺血管沖洗。拔出灌注管，結(jié)扎左肺動脈荷包縫合，左肺各支靜脈造口處縫線打結(jié)閉合。 *后開放左肺動脈及左主支氣管，恢復左肺循環(huán)，呼吸機調(diào)整為雙肺通氣。④標本留?。鹤蠓卧俟嘧? h后，取雙側(cè)等量肺組織，制備成肺組織勻漿標本。抽血液10 mL于抗凝試管并放置在離心機中，以轉(zhuǎn)速1 500 r/min進行離心。5 min后取出試管，將上層血清吸出留取血清標本。左肺再灌注4 h后，取各犬左側(cè)等量肺組織，用于肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)的測定。其余標本留取方法同上。實驗結(jié)束后，從氣管中插入灌洗管至左肺組織，留置支氣管肺泡灌洗液標本。將所有標本存放于-80℃冰箱中，以備檢測。
肺組織及血液白細胞介素17、腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素1的測定：將再灌注2，4 h時采集的肺組織勻漿及血液標本從-80℃冰箱中取出，運用ELISA檢測試劑盒，對樣品濃度進行測定。操作步驟如下：①取出酶聯(lián)板，設立空白孔、標準孔及待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μL，標準孔加標準品100 μL，待測樣品孔加實驗標本100 μL。②每孔加檢測溶液A、B工作液100μL，酶標板加上覆膜，在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)反應60 min。③溫育60 min后，棄 去孔內(nèi)液體，甩干并洗板。④每孔加底物溶液90 μL，酶標板加上覆膜，在37 ℃環(huán)境下避光顯色。⑤每孔加終止溶液 50 μL，進行終止反應，即藍色變?yōu)辄S色。⑥用酶聯(lián)儀在450 nm波長下進行比色，計算吸光度值。⑦得出數(shù)值后， 在電腦上運用軟件(curve expert 1.3)繪制曲線，對白細胞介素17、腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素1水平進行計算分析。
