頭穴透刺對腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)生長因子表達的影響
牛彥彥 鮑春齡 岳亞琳 石程
摘要 目的 觀察頭穴透刺法對腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)生長因子( NGF) 表達的影響。方法健康雄性 Wistar 大鼠120 只，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、針刺組，每組 40 只，每組再隨機分為6 h、24 h、3 d、7 d 4 個時點。采用改良的自體動脈血法制備大鼠腦出血模型，給予“百會”透“太陽”穴電針干預。通過 Longa 評分法進行神經(jīng)行為學評估，**組織化學法檢測血腫周圍腦組織 NGF 的陽性細胞表達，q- PCＲ 法檢測 NGF mＲNA 表達量。結果與假手術組比較，模型組各時點神經(jīng)行為學評分升高，NGF 陽性細胞數(shù)增多，NGF mＲNA 表達上調，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0. 05) ; 與模型組比較，針刺組 6 h 神經(jīng)行為學評分、 NGF 的陽性細胞數(shù)，NGF mＲNA 表達均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞ 0. 05) ，針刺組24 h、3 d、7 d 神經(jīng)行為學評分降低，NGF 陽性細胞數(shù)增多，NGF mＲNA 表達上調，差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜ 0. 05) 。結論 “百會”透“太陽”頭穴透刺通過上調 NGF 基因及蛋白的表達，促進腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復，具有良好的神經(jīng)保護作用。
關鍵詞 頭穴透刺; 腦出血; 神經(jīng)保護; 神經(jīng)生長因子
腦出血( intracerebral hemorrhage，ICH) 后血腫造成腦實質損害，血腫邊緣的半暗帶區(qū)發(fā)生一系列的病理生理過程，腦組織血液供應障礙，缺血缺氧，導致水腫半暗帶的細胞死亡，從而出現(xiàn)腦功能障礙。積極有效地保護腦出血后神經(jīng)元的損傷，挽救腦出血半暗帶，恢復其神經(jīng)功能，仍然是目前神經(jīng)科學研究的重點和難點。神經(jīng)生長因子( never growth factor，NGF) 具有維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)細胞存在，促進神經(jīng)細胞分化，決定軸突生長方向，促進損傷的**神經(jīng)修復，維持生存及誘導突起生長的作用，對**神經(jīng)損傷起到重要的神經(jīng)保護作用［1］。近年來人們對 NGF 結構與神經(jīng)損傷相關部位的功效有了廣泛深入地研究和認識。如 NGF 的信號傳遞路徑［2］、NGF 在炎癥疼痛及修復過程中的作用［3］、NGF 的基因表達影響因子［4］、NGF 及受體在腫瘤的形成和腫瘤疼痛中的角色 ［5］及結合神經(jīng)生長因子各種載體的基因表達［6］等方面都開展了研究。隨著對 NGF 功能的了解，對該類**及 NGF 拮抗劑**［7］用于**某些慢性**或者疼痛也進行了很多試驗和探索，但針灸對ICH 后腦組織NGF 影響的報道尚不多見［8］。而頭針透刺**腦出血的有效性，已經(jīng)在臨床實踐中得到廣泛的證實［9］。本研究通過“百會”透“太陽”頭穴透刺法觀察其對腦出血大鼠血腫周圍腦組織 NGF 表達的影響，現(xiàn)報道如下。
材料與方法
動物及分組 健康雄性 Wistar 大鼠 120 只，清潔級，體重( 300 ± 20) g，由上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號: SCXK( 滬) 2012 － 0002，實驗動物使用許可證號: SYXK( 滬) 2013 － 0109。室溫 22 ～ 25 ℃ ，相對濕度45% ～ 65% ，適應性飼養(yǎng) 1 周。按隨機數(shù)字表法分為3 組，每組 40 只，每組又隨機分 6 h、24 h、3 d、7 d 4 個時點，每個時點 10 只動物，5 只用于**組化檢測，5只用于 q-PCＲ 檢測。
主要試劑及儀器 腦立體定位儀 SＲ-6N 型 ( 日本Stoelting 公司) ，電動顱骨鉆 DB014( 北京智鼠多寶生物科技有限責任公司) ，100 μL 微量進樣器( 上海高鴿工貿有限公司) ，德國萊卡 2135 型切片機，美國Moticam3000 顯微攝影成像系統(tǒng)，華佗牌針灸針( 蘇州醫(yī)療用品廠有限公) ，電針**儀: G6805-Ⅱ型( 上海華誼醫(yī)用儀器有限公司) ，超細勻漿器 F6 /10 － 6G ( Fluko 上海流體機械制造有限公司，q-PCＲ 儀 ViiA7( life technology ABI ) ，Anti-NGF antibody ( ABCam，ab6199) ，K5007 型組化試劑盒、DAB 顯色劑( DAKO 公司) 、BioTNT 逆轉錄試劑盒等。
1 方法
3. 1 ICH 模型制作 參照任澤光的方法［10］復制腦出血模型并進行改良，調整立體定向儀使門齒鉤平面比耳間線平面低 2. 4 mm，頭顱背側剪去鼠毛，75%酒精**后于正中切開約 10 mm 縱行切口，30% 的雙氧水剝蝕骨膜，暴露前囟點 bregma，于 bregma 點正中，中線右側旁開 3. 5 mm 向后 0. 2 mm 處，用微型打磨電鉆鉆一直徑約 1 mm 的小孔，注意不傷及硬腦膜，將微量進樣器固定于此。用微量進樣器進針抽取 100 μL 自體股動脈血液，向腦內注射，深度為 6. 0 mm，勻速注射自體動脈血，10 min 內注射完畢后留針10 min，移出針頭，骨蠟封閉針孔，碘伏**，縫合頭皮。術后標準 鼠籠分籠飼養(yǎng)，給予 12 h 光照 12 h 黑暗循環(huán)，飼養(yǎng)溫度 20 ～ 25 ℃ ，相對濕度 40% ～ 65% ，自由進水及食物。
3. 2 分組處理方法 按隨機數(shù)字表法分為假手術組: 向大鼠腦內尾狀核中心部注入 100 μL 0. 9% 的生理鹽水。模型組: 向大鼠腦內尾狀核中心部注入100 μL 自體股動脈血，不做干預。針刺組: 大鼠造模成功后 1 h，給予“百會”透“太陽”穴電針干預，百會在大鼠頭頂兩耳根連線與前后中線交點( 相當于人體百會處) ，太陽在外眼角與耳之間的凹陷中( 相當于人體太陽穴) ，參照大鼠穴位圖譜的研制［11］。常規(guī)**，以0. 25 mm × 30 mm 毫針兩根，分別刺入百會( 向右前太陽穴方向) 和右側太陽穴。將 G-6805Ⅱ型電針儀正極接百會穴毫針，負極接太陽穴毫針，連續(xù)波，頻率2 Hz， 電流強度 1 mA，留針 30 min。從造模成功后 1 h開始進行針灸**，1 次/ d，直至相應時點取材。
3. 3 觀察項目及檢測方法
3. 3. 1 神經(jīng)行為學評分 大鼠蘇醒后參照 Longa 法［12］評分。0 分: 未見神經(jīng)病學征象，無神經(jīng)功能缺損癥狀; 1 分: 大鼠被提尾倒懸時，病灶右側前肢呈屈曲、抬高狀態(tài)，不能伸展右側前爪; 2 分: 有向癱瘓側旋轉的征象，即行走右側轉圈; 3 分: 有向病灶對側跌倒的征象，即行走困難并向右側傾倒; 4 分: 不能自發(fā)行走，意識水平呈下降狀態(tài)。達到 1 ～ 3 分為造模成功， 采用差額補充的方法以保證每組的實驗動物例數(shù)。
3. 3. 2 NGF 陽性細胞數(shù) 造模完成后相應的時間點，將大鼠處死、取材。先將 0. 9% 的生理鹽水和 4% 的多聚甲醛固定液 4 ℃ 預冷。10% 的水合氯醛( 0. 4 mL /100 g) 腹腔注射麻醉，打開橫膈，迅速開胸暴露心臟，立刻將輸液針頭由左心室插入主動脈，剪開右心耳， 生理鹽水快速灌注約 250 mL 后，大鼠肝臟由暗紅轉為淺黃，右心耳缺口處流出液體己澄清，換成 4% 多聚甲醛繼續(xù)灌注，先快速灌注 100 mL，剩余 150 mL 緩慢滴注。可觀察到大鼠四肢劇烈抽搐，全身多處明顯的肌肉顫 動。約30 min 后，大鼠頸部、四肢及尾部僵硬。斷頭，暴露顱骨，取出大腦。用鋒利的刀片，于冠狀位取針道前 后 1. 5 ～ 2 mm 之間的腦組織。連同包埋架一起投入4% 多聚甲醛內，于 4 ℃ 固定約 24 h，石蠟包埋，制成厚約 4 μm 的切片，進行**組化染色。
Moticam3000 顯微攝影系統(tǒng)于 400 倍下攝片，采用Image-pro plus6. 0 病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達細胞數(shù)進行分析，DAB 顯色陽性細胞呈棕黃色或褐色，每張切片隨機觀察并計數(shù)腦出血區(qū)血腫周邊 5 個不重復視野，計算陽性細胞總數(shù)。
3. 3. 3 NGF mＲNA 表達量 組織樣品按 50 ～ 100 mg / mLTrizol 加入 Trizol，用電動勻漿器充分勻漿約 1 ～ 2 min; 組織勻漿或細胞破碎后，室溫放置5 min，使其充分裂解; 12 000 r / min 離心 5 min，棄沉淀; 按 200 μL 氯仿/ mLTrizol 加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置 15 min; 4 ℃ 12 000 g 離心 15 min; 吸取上層水相，至另一離心管中; 按 0. 5 mL 異丙醇/ mL Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置 5 ～ 10 min; 4℃ 12 000 g 離心 10 min，棄上清，ＲNA 沉于管底;按 1 mL 75 % 乙醇/ mL Trizol 加入 75 % 乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀; 4 ℃ 8 000 g 離心 5 min，盡量棄上清; 室溫晾干或真空干燥 5 ～ 10 min; 用 50 μL H2 O，溶解 ＲNA 樣品，55 ～ 60 ℃ 5 ～ 10 min。取去除核酸酶的無菌 EP 管，放置冰上; 分別加入 Oligo ( dT) 1 μL，模板 ＲNA 2 μL，去核酸酶的水 9 μL; 70 ℃ 加熱 5 min，立即將微量離心管插入冰浴中至少 1 min; 再分別加入 Buffer 5 μL，dNTP 1. 25 μL，ＲNA 酶抑制劑 0. 375 μL，逆轉錄酶 1 μL，補足水至總體積 25 μL; 42 ℃ 反應持續(xù) 60 min 終止反應; 所得產物即 cDNA，－ 80 ℃ 保存。設置內參 GAPDH 引物: 上游引物序列 5 ' -GTG CCA GCC TCG TCT CAT A-3 ' ，下 游引物序列 5 ' -GAA CTT GCC GTGGGT AGA G-3 ' ; 引物長度: 187 bp NGF 上游引物5 ' -AGT GTG TGG GTT GGA GAT A-3 ' ，下游引物: 5'- AAA GGT GTG AGT CGT GGT G-3'，引物長度: 204 bp設置PCＲ 反應體系: 2 × 熒光染料混合物 5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，cDNA 模板0. 5 μL，去 ＲNA 酶水定容至 10 μL。PCＲ 擴增反應條件為預變性 95 ℃ 10 min，變性 95 ℃15 s，退火延伸 60 ℃ 30 s，經(jīng) 40 個循環(huán); PCＲ 溶解反應條件為 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s( 0. 3 ℃ / s) ，95 ℃ 15 s。通過 2－ △Ct*終算得樣品 mＲ-NA 的相對含量。
3. 4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 20. 0 軟件進行統(tǒng)計，計量數(shù)據(jù)采用x ±s 表示，3 組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗，P ＜ 0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。
結 果
各組大鼠不同時間點神經(jīng)行為學評分比較 ( 表 1) 假手術組大鼠未見明顯的神經(jīng)功能變化。造模成功后模型組大鼠出現(xiàn)病灶對側上下肢癱瘓，表現(xiàn)為肢體活動減少或肢體無力，多數(shù)大鼠不能直行，站立不穩(wěn)，呈“劃圈樣”步態(tài); 術后 6 h 模型組出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，24 h 模型組神經(jīng)缺損*為嚴重，3 d 時逐漸減輕，至第 7 d 時，神經(jīng)缺損癥狀又進一步減輕，但行為學評分仍在 2 分以上。針刺組在 24 h 及 3、7 d 時均較模型組行為學評分減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0. 05) 。
各組大鼠不同時點血腫周圍腦組織 NGF 陽性細胞數(shù)比較( 表 2，圖 1) 假手術組可見少量 NGF 陽性細胞表達，且在各時點無明顯變化。模型組 NGF 在血腫周圍開始出現(xiàn)表達增加，24 h、3 d 時 NGF 陽性細胞數(shù)繼續(xù)增加，7 d 時達*高。從陽性細胞的形態(tài)來看，大部分為神經(jīng)元細胞，胞體較大，形態(tài)較規(guī)則，** 陽性顆粒位于胞體和突起，呈均勻的棕黃色顆粒。小部分是小膠質細胞，呈圓形或橢圓形，形態(tài)不規(guī)則，陽性顆粒位于細胞胞質。與假手術組比較，模型組各時點 NGF 陽性細胞數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0. 05) ; 與模型組比較，針刺組 24 h 及 3、7 d 時NGF 陽性細胞數(shù)均增多，差異亦有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0. 05) 。
各組大鼠不同時點血腫周圍腦組織 NGF mＲ- NA 表達量比較( 表 3) 取 GAPDH 作為內參。腦出血后 6、24 h 及 3、7 d，假手術組大鼠 NGF mＲNA 表達量未見明顯變化; 腦出血后 6 h，模型組 NGF mＲNA 表達量開始升高，24 h 達*高，后開始降低，至 7 d 時*低。與假手術組比較，模型組各時點 NGF mＲNA 表達均上調，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0. 05) ; 針刺組 24 h 及3、7 d 時，NGF mＲNA 表達量均上調，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0. 05) 。