創(chuàng)傷性應激障礙樣大鼠海馬 GABA
創(chuàng)傷后應激障礙 ( post-traumatic stress disor- der，PTSD) 是一種復雜的焦慮障礙。患者在經(jīng)歷了嚴重的創(chuàng)傷性事件后，表現(xiàn)出回避性行為，恐懼增強及后覺醒狀態(tài)［1］。PTSD 的病因復雜，其機制的探索首先需要建立一個良好的動物模型模擬PTSD 的特征，即: ①具有短期強烈的應激事件;②模擬 PTSD 患者的核心癥狀，即對創(chuàng)傷性線索的反應性增強，過度覺醒以及社會回避表現(xiàn); ③癥狀可持續(xù)存在甚至隨著時間而增強［2］。單次延長刺激模型 ( single-prolonged stress，SPS) 能夠較好模擬 PTSD 發(fā)病過程及患者出現(xiàn)的部分核心癥狀，如逐漸產生的焦慮行為和過度覺醒，因此日漸受到研究者的關注，并廣泛用于 PTSD 的神經(jīng)生物學機制研究［3］。SPS 造模［4］是一個連續(xù)的過程，這種連續(xù)性應激可使動物對條件恐懼僵住反應增強，同時損壞其恐懼記憶的消退功能，*終導致動物對創(chuàng)傷無關的刺激做出過度的生理和行為反應［4］。γ-氨基丁酸 ( γ-aminobutyric acid，GABA) 是**神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質，可以調節(jié)機體面對應激時的生理反應［5］。GABA 受體包括離子型的 GABAA 和 G-蛋白偶聯(lián)的 GABAB 受體兩種亞型，均在焦慮調節(jié)中發(fā)揮重要作用［6］。分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn) GABA 系統(tǒng)和 PTSD 的發(fā)生具有關聯(lián)性，例如，GABA β3 亞基 3 ＇端的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性和 PTSD 的發(fā)生率存在相關性［7］。另有研究發(fā)現(xiàn) PTSD 患者的腦內 GABA 水平降低［8］。因此GABA 系統(tǒng)的功能異?？赡軈⑴c PTSD 的發(fā)生。海馬是負責空間學習記憶的重要腦區(qū)，主要功能是將短期記憶固化為長期記憶以及空間記憶的形成。同時，大量研究表明海馬也參與應激及情緒的調節(jié)［3］。影像學研究發(fā)現(xiàn) PTSD 患者的海馬，同遭受應激但是沒有 PTSD 癥狀的人相比顯著縮小［9］，提示海馬的功能異常可能參與 PTSD 的發(fā)生。CA1 和CA3 是海馬的重要亞區(qū)，CA3-CA1 突觸傳遞在學習記憶和應激反應中發(fā)揮重要作用。但研究發(fā)現(xiàn)CA3 和 CA1 對應激的反應，如應激導致的長時程增強 ( long-term potentiation，LTP) 及一些基因的表達調節(jié)是不同的，這取決于應激的種類和應激時間［10-11］。因此在本研究中我們將應用 SPS 作為 PTSD 的動物模型，驗證 SPS 所導致的增強的焦慮性行為并觀察其對海馬 CA1 和 CA3 亞區(qū) GABAA 和 GABAB 受體的蛋白表達量的影響。
1 對象與方法
1. 1 實驗動物
雄性 Sprague-Daw ley ( SD ) 大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號: S ( 京) 2001 － 2003，體重平均在 200 ～ 220g。采用12 小時晝夜節(jié)律控制 (8: 00 － 20: 00 )。實驗室濕度和溫度均符合實驗標準。實驗開始前，動物在動物房適應性飼養(yǎng) 7 d，自由飲水，進食。實驗大鼠隨機分為未造模組、SPS 造模 1 d 和SPS 造模 14 d 組，每組各 8 只。經(jīng)過造模后，SPS 造模 1 d 和SPS 造模14 d 所剩動物分別為7 只和6 只。應用曠場和高架十字實驗測試 3 組大鼠的焦慮程度; 行為學測試 24 h 后，斷頭取腦檢測 CA3 和 CA1 腦區(qū)GABAA 和 GABAB 的表達情況。
1. 2 實驗材料和試劑
強迫游泳，北京智鼠多寶生物科技有限責任公司; 電泳儀、電泳槽，北京伯樂生命科學發(fā)展有限公司; 大鼠束縛容器，北京大學中國**依賴性研究所; 高架十字迷宮，中國醫(yī)科院協(xié)和**所。抗兔GABAA 抗體 ( Abcam，美國)，抗兔GABAB 抗體 ( Abcam，美國)，抗小鼠 β-Actin 抗體 ( 中杉金橋，中國)，辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠 IgG抗體 ( 中杉金橋，中國)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG 抗體 ( 中杉金橋，中國)。
1. 3 PTSD 模型的建立
成年SD 大鼠，在動物房適應性飼養(yǎng)7 d 左右.首先使用硬質塑料盒 ( 使大鼠四肢及軀干束縛在瓶中，尾巴露在外面) 給予大鼠 2 h 的束縛，緊接著讓其在 20 ～ 24 ℃ 水溫進行 20 min 的強迫游泳， 之后休息15 min，*后用乙醚麻醉直至無抵抗。束縛期間溫度和濕度都與正常飼養(yǎng)環(huán)境一致，待應激結束后分籠放回動物房飼養(yǎng)。
開臂區(qū)停留時間及 EPM 指數(shù)顯著降低 ( P ＜0. 05); 造模 1 d 組差異沒有統(tǒng)計學意義 ( P ＞ 0. 05) ( 表 2)。
2. 2 大鼠 SPS 應激后海馬 CA1 和 CA3 腦區(qū)的 GA- BA 受體表達水平
Western blot 發(fā)現(xiàn)，不同處理組間 CA1 腦區(qū)GABAA 受體和 GABAB 受體表達差異有統(tǒng)計學意義，Post-hoc 分析發(fā)現(xiàn)，同未造模動物相比，造模 14 d 組大鼠 CA1 腦區(qū)的 GABAA 受體和 GABAB 受體的表達含量顯著降低 ( P ＜ 0. 05 ); 造模 1 d 組差異沒有統(tǒng)計學意義 ( P ＞ 0. 05) ( 表 3)。
不同處理組間 CA3 腦區(qū) GABAA 受體和 GAB- AB 受體表達差異有統(tǒng)計學意義，Post-hoc 分析發(fā)現(xiàn)，同未造模動物相比，造模 14 d 組大鼠 CA3 腦
區(qū) GABAA 受體和 GABAB 受體的表達含量顯著降低 ( P ＜ 0. 05 ); 造模 1 d 組差異沒有統(tǒng)計學意義( P ＞ 0. 05) ( 表 4)。
3 討 論
創(chuàng)傷后應激障礙的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，主要是 患者在經(jīng)歷精神創(chuàng)傷性事件后數(shù)天至數(shù)月內發(fā)生的 創(chuàng)傷性經(jīng)歷再體驗、情感麻木、回避行為和過度覺 醒導致的易激惹狀態(tài)［1］。建立效度好的動物模型 是研究 PTSD 發(fā)病機制的關鍵手段之一，但目前仍無一個被廣泛接受的動物模型。之前的研究已經(jīng)構 建了一些動物模型如電擊模型，捕食者場景模型以 及邊緣系統(tǒng)點燃模型等［2］。雖然這些模型在一定 程度上模擬創(chuàng)傷性應激，但是對于一些 PTSD 的關鍵特征，如由創(chuàng)傷性應激導致的時間依賴性增強的 敏感化表現(xiàn)并不能很好的模擬［4］。有研究表明，
Liberzon 等建立的 SPS 動物模型可較好地模擬PTSD 患者出現(xiàn)的恐懼記憶、焦慮反應增強、警覺性明顯增高及相關神經(jīng)***改變［4］。同時，經(jīng)歷了 SPS 的動物還表現(xiàn)出恐懼記憶消退受損，進而導致動物對與創(chuàng)傷無關的刺激做出過度的生理和行為反應。因此，SPS 動物模型已經(jīng)成為目前常用的PTSD 動物模型之一［3］。本研究采用SPS 動物模型，發(fā)現(xiàn)動物經(jīng)歷 SPS 造模后第 1 天的焦慮樣行為無顯著性變化，而在第 14 天的焦慮樣行為顯著升高，驗證了 Serova 等多個課題組關于 SPS 可以導致延遲性發(fā)生的焦慮反應增強和警覺度增高的現(xiàn) 象［14］，表明 SPS 模型具有好的效度和重復性。
有研究指出，海馬在調控應激和焦慮樣行為中發(fā)揮著重要作用［15］。長期束縛應激導致大鼠海馬CA3 亞區(qū)神經(jīng)元樹突萎縮，動物在高架十字迷宮開放臂中的探索減少［16］。機體在遭受應激時 CA3- CA1 的 LTP 受損同時伴隨有 BDNF 的降低［10，17］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后應激障礙患者對環(huán)境性線索 的識別受損，提示海馬功能受損可能在 PTSD 發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。GABA 是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性遞質，可以防止神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活及谷氨 酸的過度釋放［18］。動物實驗發(fā)現(xiàn)慢性應激可導致 海馬 CA1 和 CA3 區(qū) GABA 能神經(jīng)元數(shù)量降低［19］， 慢性暴露于應激水平的腎上腺皮質**導致海馬GABAA 受體亞基表達異常，但是不同亞基表達變化在 CA1 和 CA3 區(qū)呈現(xiàn)不同的模式［11］。臨床發(fā)現(xiàn)，GABA β3 3＇端的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性和 PTSD的發(fā)生率存在相關性［7］。本研究發(fā)現(xiàn) SPS 造模 14 d 后海馬 CA1 和 CA3 亞區(qū)中的 GABAA 和 GABAB 蛋白表達均顯著性降低，這和其焦慮樣行為出現(xiàn)的 時間點相符，這和前人關于機體遭受應激 CA3- CA1 的 GABA 遞質傳遞調控異常的研究相一致， 并進一步提示海馬的 GABA 受體異常表達可能調控 PTSD 部分癥狀發(fā)生，如增強的焦慮及警覺度。本研究的不足之處是未對 SPS 導致的其他PTSD 樣行為特征如恐懼記憶的形成和消退的影響， 及PTSD 樣行為和 GABA 受體的表達降低進行因果關系探索。因此，今后的研究中我們將對 CA1 和CA3 腦區(qū) GABA 受體進行調節(jié)， 以便觀察海馬CA1 和 CA3 腦區(qū) GABA 受體的異常表達是否調控了大鼠 PTSD 樣行為的產生。